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卵白质表达与纯化实验

2015-07-01
|
会见量：

一、卵白质表达与纯化实验原理

（一）使用大肠杆菌表达举行原核表达

基因工程的最终目的是在一个合适的系统中 ，，，，，使外源基因高效表达 ，，，，，从而生产有价值的卵白质产品。。。。

1.原核生物基因表达的特点

（1）原核生物（如大肠杆菌）只有一种RNA聚合酶 ，，，，，识别原核的启动子 ，，，，，能够催化所有RNA合成。。。。

（2）原核生物的基因表达是以使用子为单位。。。。使用子是数个相关的结构基因及其调控区的连系 ，，，，，是一个基因表达的协同单位。。。。

（3）由于原核生物无核膜 ，，，，，以是转录与翻译是耦联的 ，，，，，二者也是一连举行的。。。。原核生物染色体DNA是裸露的环型DNA ，，，，，转录成mRNA后 ，，，，，可直接在胞浆中与核糖体连系翻译成卵白质。。。。每个核糖体可自力完成一条链的合成 ，，，，，多核糖体可同时在一条mRNA合成多条肽链 ，，，，，大大提高了翻译效率。。。。

（4）原核基因不含内含子（intron） ，，，，，没有转录后加工历程。。。。

（5）原核生物基因表达的控制主要是在转录水平。。。。对RNA合成的调控有两种方法：启始控制（启动子控制）和终止控制（衰减子控制）。。。。

（6）在大肠杆菌mRNA的核糖体连系位点上 ，，，，，有一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA 3′最后碱基互补的序列 ，，，，，即SD序列 ，，，，，真核基因则无此序列。。。。

2.外源基因在原核中表达的要害

（1）表达载体将外源基因导入宿主菌 ，，，，，指导宿主菌的酶系统合成外源卵白；；；

（2）外源基因不可带有内含子；；；

（3）使用原核细胞的强启动子和SD序列等控制外源基因的表达；；；

（4）外助基因与表达载体毗连后 ，，，，，必需形成准确的开放阅读框架；；；

（5）使用宿主菌的调控系统 ，，，，，调理外源基因的表达 ，，，，，避免表达的外源基因产品对宿主菌的迫害。。。。

3.外源基因在原核细胞中表达的主要调控元件

（1）启动子

-35区：位于转录启始位点上游35bp处 ，，，，，一样平常由10bp组成 ，，，，，与RNA聚合酶δ亚基连系；；；

-10区（TATA box）：位于转录启始位点上游5-10bp处 ，，，，，一样平常由6-8bp ，，，，，富含A T ，，，，，与RNA聚合酶的焦点酶连系。。。。

原核表达载体所用的启动子必需是原核启动子 ，，，，，通常所用的可调控的强启动子有：lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子） ，，，，，λPL（λ噬菌体左向启动子） ，，，，，Tac（乳糖和色氨酸的杂和启动子）等。。。。

（2）SD顺序

mRNA在细菌中转译率严酷依赖于SD序列以及SD序列与启始密码子AUG之间的距离 ，，，，，例如 ，，，，，当lac启动子的SD序列距AUG为7个核苷酸时 ，，，，，IL-2表达最高 ，，，，，为2581单位 ，，，，，而距离8个核苷酸时 ，，，，，表达水平降到缺乏5个单位。。。。另外某些卵白质与SD序列连系也回影响卵白质的翻译。。。。

（3）终止子（terminator）

4.原核表达载体的类型

（1）非融合型

不与细菌的任何卵白或多肽融合在一起的表达卵白。。。。

优点：很是靠近于生物体内自然卵白质；；；

弱点：容易被细菌卵白酶破损 ，，，，，未知卵白难于纯化。。。。

（2）融合型

卵白质的一端由原核DNA序列或其它序列编码 ，，，，，另一端由真核DNA的完整序列编码。。。。

优点：应该阻止细菌卵白酶的破损 ，，，，，由于融合部分的关系 ，，，，，常易于表达产品的疏散纯化。。。。

弱点：由于细菌的一段卵白或多肽的保存 ，，，，，有时会影响其结构 ，，，，，需去掉。。。。

5.用于原核细胞表达的外源基因

由于原核细胞缺乏真核细胞转录后的加工系统 ，，，，，mRNA的内含子不可切除 ，，，，，成熟的mRNA不可形成 ，，，，，同时原核细胞也缺乏真核细胞翻译后的加工系统。。。。只能用cDNA而不可用基因组DNA ，，，，，或体外合成基因 ，，，，，PCR扩增基因等。。。。

（二）使用HIC树脂纯化ZsGreen卵白

甲基化疏水反应层析（HIC）树脂是使用疏水基团举行疏散卵白的一种简朴而有用的要领。。。。连系缓冲液中的Cl-倾轧带负电荷的ZsGreen分子的β-外壳 ，，，，，这种倾轧使分子内部外翻 ，，，，，露出疏水基团。。。。露出的疏水基团牢牢与HIC树脂的非极性甲基基团连系；；；中性盐洗脱使ZsGreen坚持为疏水状态；；；可是可以洗脱未连系或者是连系弱的卵白；；；低盐缓冲液使疏水基团回到ZsGreen分子的原来位置 ，，，，，从而使ZsGreen分子HIC树脂中释放。。。。

（三）SDS-PAGE剖析

聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构 ，，，，，具有分子筛效应 ，，，，，它有两种形式 ，，，，，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶 ，，，，，卵白质在电泳中坚持完整的状态 ，，，，，卵白在其中依三种因素脱离：卵白巨细 ，，，，，形状和电荷。。。。而SDS-PAGE仅凭证卵白分子量亚基的差别而疏散卵白。。。。这个技术首先是1967年由shapiro建设 ，，，，，他们发明在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后 ，，，，，卵白质亚基的电泳迁徙率主要取决于亚基分子量的巨细 ，，，，，电荷因素可以忽视。。。。

SDS是阴离子去污剂 ，，，，，作为变性剂和助溶试剂 ，，，，，它能断裂分子内和分子间的氢键 ，，，，，使分子去折叠 ，，，，，破损卵白分子的二、三级结构。。。。而强还原剂如巯基乙醇 ，，，，，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。。。。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后 ，，，，，分子被解聚成多肽链 ，，，，，解聚后的氨基酸侧链和SDS连系成卵白——SDS胶束 ，，，，，所带的负电荷大大凌驾了卵白原有的卵白量 ，，，，，这样就消除了差别分子间的电荷差别和结构差别。。。。SDS-PAGE一样平常接纳的是不一连缓冲系统 ，，，，，于一连缓冲系统相比 ，，，，，能够有较高的区分率。。。。

浓缩胶的作用是有群集作用 ，，，，，凝胶浓度较小 ，，，，，孔径较大 ，，，，，把较稀的样品加在浓缩胶上 ，，，，，经由大孔径凝胶的迁徙作用而被浓缩至一个狭窄的区带。。。。当样品液和浓缩胶选Tris-HCl缓冲液 ，，，，，电极液选Tris-甘氨酸。。。。电泳最先后 ，，，，，HCl解离成Cl- ，，，，，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。。。。卵白质带负电荷 ，，，，，因此一起向正极移动 ，，，，，其中Cl-最快 ，，，，，甘氨酸根离子最慢 ，，，，，卵白居中。。。。电泳最先时Cl-泳动率最大 ，，，，，凌驾卵白 ，，，，，因此在后面形成低电导区 ，，，，，而电场强度与低电导区成反比 ，，，，，因而爆发较高的电场强度 ，，，，，使卵白和甘氨酸根离子迅速移动 ，，，，，形成以稳固的界面 ，，，，，使卵白群集在移动界面周围 ，，，，，浓缩成一中心层。。。。

本实验中 ，，，，，我们首先提取大肠杆菌（E.coli）基因组 ，，，，，PCR扩增冷激卵白CspA的启动子、上游调控及下游5′-UTR区序列 ，，，，，获得cspA1、cspA2和cspA3 ，，，，，在两头引入酶切位点；；；用限制性内切酶切割质粒pZsGreen1-1 ，，，，，获得绿色荧光卵白ZsGreen报告基因；；；以pET-28a（+）为骨架 ，，，，，酶切、毗连 ，，，，，构建含冷激启动子、报告基由于ZsGreen的表达载体pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen（图1）及比照常温表达载体pT7-ZsGreen（图5-1）。。。。

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二、实验仪器及药品 （1）STE的配制（表3-1）

表3-1STE（100mL）配方

试剂名称

试剂品级

用量

最终浓度

5mol/L NaCl

剖析纯

2mL

0.1mol/L

1mol/L Tris-HCl（pH8.0）

剖析纯

1mL

10mmol/L

0.5mol/L EDTA（pH8.0）

剖析纯

200μL

1mmol/L

dH2O

不需灭菌

up to 100mL

—

在60mL dH2O中加入5mol/L NaCl 2mL、1mol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mL和0.5mol/L EDTA（pH8.0）200μL ，，，，，混匀 ，，，，，加dH2O定容至100mL ，，，，，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min ，，，，，备用。。。。配制好的STE含有0.1mol/L NaCl ，，，，，10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA。。。。

（2）溶液I的配制（表3-2）

表3-2溶液I（100mL）配方

试剂名称

试剂品级

用量

最终浓度

葡萄糖

剖析纯

0.9g

50mmol/L

1mol/L Tris-HCl（pH8.0）

剖析纯

2.5mL

25mmol/L

0.5mol/L EDTA（pH8.0）

剖析纯

2mL

10mmol/L

dH2O

不需灭菌

up to 100mL

—

60mL dH2O中加入0.9g葡萄糖、1mol/L Tris-HCl（pH8.0） 2.5mL和0.5mol/L EDTA（pH8.0）  2mL ，，，，，混匀 ，，，，，加dH2O定容至100mL ，，，，，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min ，，，，，4℃贮存。。。。配制好的溶液I含有50mmol/L葡萄糖 ，，，，，25mmol/L Tris-HCl和10mmol/L EDTA。。。。

（3）溶液II的配制（表3-3）

溶液II中含有0.4mol/L NaOH和1% SDS ，，，，，该试剂需要新鲜配制 ，，，，，配制后将NaOH和SDS按1：1的比例混淆。。。。

表3-3溶液II（1mL）配方

试剂名称

试剂品级

用量

最终浓度

5mol/L NaOH

剖析纯

40μL

0.4mol/L

dH2O

不需灭菌

up to 500μL

—

2%SDS

剖析纯

500μL

1%

dH2O

不需灭菌

up to 500μL

—

（4）溶液III的配制（表3-4）

表3-4溶液III的配制（100mL）

药品名称

用量

5mol/L KAc

60mL

冰醋酸

11.5mL

dH2O

28.5mL

配制好的溶液III含3mol/L KAc、5mol/L冰醋酸（pH4.8）。。。。

三、质粒抽提实验要领

质粒提取历程如下：

（1）将琼脂作育板上的阳性单菌落 ，，，，，移至3mL LB液体作育基中（含Amp或Kana） ，，，，，或将大肠杆菌的甘油菌按1：30的比例接到LB液体作育基中 ，，，，，37℃强烈摇荡作育住宿；；；

（2）取500μL菌体 ，，，，，与40%甘油等体积混淆 ，，，，，-70℃生涯 ，，，，，剩余的菌体用于质粒的提�。。。�；；；

（3）取出1.5-2mL菌液移至Eppendorf管中 ，，，，，12000rpm ，，，，，4℃离心30s ，，，，，弃上清 ，，，，，用1mL    STE悬浮菌体沉淀 ，，，，，洗涤菌体 ，，，，，再离心接纳菌体；；；

（4）再重复用STE漂洗菌体 ，，，，，离心后 ，，，，，去尽上清液；；；

（5）将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中 ，，，，，强烈振荡混匀；；；

（6）加入200μL新配制的溶液II ，，，，，轻轻倒置离心管5次以混淆内容物 ，，，，，不要强烈振荡 ，，，，，安排冰上3min左右（凭证差别菌株 ，，，，，可适当缩短）；；；

（7）加入150μL冰预冷的溶液III ，，，，，轻轻倒置5次 ，，，，，混匀 ，，，，，置于冰上5min；；；

（8）15000rpm ，，，，，4℃离心5min ，，，，，将上清转移到另一个离心管中；；；

（9）向上清中加入等体积的酚：氯仿（1：1） ，，，，，混匀 ，，，，，15000rpm离心5min ，，，，，将上清转移到另一个离心管中；；；

（10）加入2倍体积冰预冷的无水乙醇 ，，，，，室温安排2min ，，，，，沉淀双链DNA；；；

（11）15000rpm ，，，，，4℃离心5min；；；

（12）倒掉上清 ，，，，，使液体只管流尽 ，，，，，空气中干燥沉淀；；；

（13）用20μL含有RNaseA的TE缓冲液消融核酸沉淀 ，，，，，瞬时离心 ，，，，，混匀 ，，，，，贮存于-20℃冰箱中备用。。。。

四、实验效果

（一）未纯化SDS-PAGE剖析

将含有pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen的大肠杆菌（E.coli） ，，，，，在16℃表达；；；含有pT7-ZsGreen的大肠杆菌（E.coli）在37℃下表达至OD600＝0.6时 ，，，，，加入IPTG诱导表达 ，，，，，不加IPTG诱导的作为比照。。。。诱导表达5h后网络菌体 ，，，，，举行SDS-PAGE剖析（图5-2）。。。。

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图5-2中 ，，，，，M为低分子量卵白Maker。。。。1-5划分为pT7-ZsGreen（IPTG- ，，，，，37℃）、pT7-ZsGreen（IPTG+ ，，，，，37℃）、pCspA1-ZsGreen（16℃）、pCspA2-ZsGreen（16℃）、pCspA3-ZsGreen（16℃）表达ZsGreen。。。。箭头所示为ZsGreen ，，，，，其巨细约为27KD。。。。SDS-PAGE效果显示：三种低温诱导表达载体pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen在16℃下表达ZsGreen正常 ，，，，，可用作下一步对其翻译效率的剖析。。。。

（二）纯化后SDS-PAGE剖析

将含有低温诱导表达载体pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen的大肠杆菌（E.coli） ，，，，，在16℃下表达 ，，，，，以1h为时间距离网络菌体 ，，，，，使用HIC树脂纯化ZsGreen卵白 ，，，，，举行SDS-PAGE剖析（图5-3）。。。。

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图5-3中 ，，，，，M为低分子量卵白Maker。。。。A1-7、B8-14、C15-21划分为pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen 16℃表达4h HIC纯化后SDS-PAGE。。。。箭头所示为ZsGreen ，，，，，其巨细约为27KD

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